Советы и хитрости для лаборатории: Устранение неполадок с колонками и альтернативы

Колонковая хроматография — широко используемый метод очистки в лабораториях по всему миру. При правильном подходе она позволяет просто и быстро выделить нужные соединения из смеси. Но, как и многие аспекты практической химии, быстрая и эффективная настройка и работа колонки — это то, на освоение чего могут уйти годы. Здесь мы приводим некоторые советы и рекомендации по работе колонки, устранению некоторых проблем, часто возникающих при колоночной хроматографии, а также некоторые “быстрые и грязные” альтернативы полной колонке.

Запуск колонки

Ранее мы рассмотрели как упаковать колонку и как выбрать необходимое оборудование и растворители. Как только вы все подготовите, вы будете готовы к загрузке и запуску колонки. Загрузка колонки заключается в том, что образец помещается непосредственно на верхнюю часть колонки и впитывается в кремнезем.

Для загрузки колонки:

1. Растворите образец в минимальном количестве растворителя (5–10 капель). Можно использовать чуть более полярный растворитель, чем тот, который вы будете использовать для колонки, если это поможет растворению образца. Если вам необходимо использовать такой растворитель, как дихлорметан или что-то более сильное, предпочтительным может оказаться метод сухой загрузки, описанный ниже..
2. Используя пипетку или шприц с толстой иглой, капните образец непосредственно на верхнюю часть кварцевого стекла. Старайтесь не нарушать поверхность. В идеале образец должен быть равномерно распределен по поверхности так, чтобы он образовал тонкую горизонтальную полосу.
3. После того, как весь образец будет распределен по поверхности, он должен быть нанесен на кремнезем.
4. Когда весь образец будет добавлен, дайте колонке стечь так, чтобы уровень растворителя касался верхней части диоксида кремния.
5. Осторожно добавьте слой песка (примерно 2–5 мм). Это поможет предотвратить нарушение поверхности кремнезема при добавлении растворителя.
6. Используя пипетку, осторожно добавьте еще растворителя так, чтобы уровень растворителя был примерно на 10 мм выше верха песка.
7. Дайте растворителю стечь, пока уровень растворителя не будет примерно на 1– 2 мм выше верха песка.
8. Повторите шаги 5 и 6 еще один или два раза. Это обеспечит впитывание образца в диоксид кремния.
9. В заключение добавьте необходимое количество растворителя. Теперь вы готовы приступить к работе с колонкой.

Если ваше соединение плохо растворимо в системе растворителей, обеспечивающей наилучшее разделение, можно загрузить образец в колонку сухим способом.

Для сухой загрузки вашего соединения вам понадобится:

Круглодонная колба

Сухой диоксид кремния

Растворитель, в котором образец полностью растворяется

Ротационный испаритель

Метод:

1. Растворите образец в соответствующем растворителе. Перенесите его в круглодонную колбу, если он еще не находится в ней.
2. Добавьте сухой диоксид кремния к растворенному образцу (примерно в 10– 20 раз больше массы образца).
3. Осторожно перемешайте, чтобы весь кремнезем был взвешен в растворе.
4. Осторожно выпарите растворитель с помощью роторного испарителя, пока кремнезем не станет сухим и свободно текучим. Если он все еще представляет собой масло, добавьте еще кремнезема и повторите процедуру.
5. Осторожно добавьте растворитель в колонку так, чтобы уровень растворителя был примерно на 2–3 см выше верха кремнезема. Используйте пипетку, чтобы не нарушить поверхность кремнезема.
6. Налейте сухой кремнезем в колонку.
7. Всыпьте сухой диоксид кремния, насыщенный образцом, в колонку и дайте ему осесть. Следите за тем, чтобы уровень растворителя всегда оставался выше верха кремнезема и не было пузырьков. Лучший способ сделать это — медленно добавлять насыщенный кремнезем.
8. Последуйте шагам 4–8 вышеописанного метода мокрой загрузки для полного поглощения образца на колонке.

Собирание дробей

Чтобы начать сбор фракций, поставьте под колонку подходящий контейнер и откройте запорный кран или краник. Для каждой колонки существует оптимальная скорость потока. Отрегулируйте запорный кран, чтобы контролировать поток. Если скорость потока слишком медленная, диффузионные процессы приведут к расширению полосы (рис. 1, а). Если скорость потока слишком велика, времени на уравновешивание будет недостаточно, и соединение будет вытесняться вниз по колонке, оставляя за собой длинный хвост (рис. 1, в). Для колонок малого диаметра оптимальная скорость ниже, чем для колонок большего диаметра. Поэтому на колонках большего диаметра можно использовать более высокую скорость потока, чем на колонках меньшего диаметра.

Рисунок 1. Изменение скорости потока может изменить качество разделения. Оптимальная скорость потока показана на рисунке b).

Никогда нельзя допускать, чтобы уровень растворителя опускался ниже верха кремнезема (“пересыхание”). Растворитель следует пополнять регулярно и задолго до того, как возникнет опасность, что это может произойти. Доливайте растворитель, когда над защитным слоем песка остается более 2 см растворителя. Добавление растворителя на ранней стадии, то есть когда в колонке еще есть растворитель, также поможет свести к минимуму нарушение поверхности кремнезема и, как следствие, нарушение любых полос, все еще присутствующих в верхней части колонки.

Существует мертвый объем, в котором не будет образца. Размер мертвого объема зависит от размера колонки и разделяемых соединений. Вы можете увидеть линию, соответствующую полярному растворителю, использованному для растворения образца. Это может быть хорошим ориентиром того, когда следует начинать сбор фракций. Если вы не видите линии полярного растворителя, отметьте уровень исходного растворителя, нарисовав его на внешней стороне колонки несмываемой ручкой. Сделайте вторую отметку на колонке под первой, соответствующую двум третям длины кремнезема (рис. 2). Как только уровень растворителя опустится ниже второй отметки, самое время начать сбор фракций. Если у вас есть сомнения относительно положения вашего соединения на колонке, начинайте собирать фракции раньше, а не позже.

Рисунок 2. Оценка мертвого объема.

Размер фракции

Для больших колонок нет смысла собирать много мелких фракций: Они в конечном итоге будут рекомбинированы. Однако сбор всего нескольких крупных фракций может привести к тому, что вы получите две полосы в одной фракции, особенно если полосы выходят из колонки близко друг к другу или наблюдается хвост ведущей полосы.

Приблизительный ориентир идеального размера фракции приведен в табл. 1.

Таблица 1. Приблизительные размеры фракций для колонок разного размера.

Таблица 1.  

Как определить, какая из собранных фракций содержит мой продукт?

Нанесите немного каждой фракции на пластину для ТЛК и проявите ее, как для тестовой ТЛК. Сделайте пластины TLC большего размера, чем обычно (примерно 5 x 7 см), чтобы можно было проверить 5-10 фракций на пластину.

Подробнее смотрите Как провести тест TLC.

Флэш-колоночная хроматография

Если вы используете флэш-колонку, необходимо контролировать еще один важный параметр: давление.

Давление газа обычно устанавливается на уровне 1–2 psi. Оно может быть выше (2–4 psi), если вы используете очень мелкий кремнезем. Вязкие растворители, такие как бутанол или вода, также могут потребовать давления выше 2 фунтов на квадратный дюйм. 

Для стеклянных колонок абсолютный предел составляет 7 psi!

Стеклянный газозаборник можно закрепить вручную или с помощью пластикового быстроразъемного зажима, поскольку он отскочит, если давление станет слишком высоким. Не рекомендуется использовать другие зажимы или способы крепления газового ввода. Стеклянные газовые вводы также могут разбиться, если в результате сброса давления они упадут или ударятся о твердую поверхность. Для дополнительной безопасности газ можно подавать через иглу шприца, проколотую через незакрепленную резиновую перегородку. Перегородка выскочит, если давление станет слишком высоким, но не сломается при ударе.

Устранение неполадок

Ранее мы рассмотрели, как упаковать колонку и как выбрать необходимое оборудование и растворители. Но как бы тщательно вы ни упаковывали колонну, ни выбирали растворители, ни запускали колонну, все равно что-то может пойти не так. Прежде всего, не паникуйте: часто все не так плохо, как кажется на первый взгляд. Далее, помните, что вы не одиноки. Хотя каждая проблема уникальна, многие люди сталкивались с подобными проблемами и находили решения. Здесь мы приводим некоторые из наиболее распространенных проблем и их наиболее вероятные решения (табл. 2). 

Таблица 2. Распространенные проблемы, возникающие при колоночной хроматографии, и их решения.

2D TLC

Двухмерная ТЛК полезна для определения стабильности соединения на кремнеземе или для образцов, содержащих большое количество компонентов.

Для проведения двумерной ТСХ вам понадобится:

Лист ТЛК

ножницы/нож Стенли/коробочный резак

Карандаш

Стеклянный сосуд, например, маленькая мензурка с часовым стеклом или чашка Петри в качестве крышки

Растворитель (растворители) для тестирования

Капиллярный TLC-споттер или микропипетка (см.: Как сделать капиллярный TLC-споттер)

Пинцет

Ультрафиолетовая лампа или перманганат калия для визуализации TLC

Метод:

1. Разрежьте лист TLC на квадрат. Хороший размер — 7 см х 7 см, но сначала убедитесь, что он поместится в контейнер для растворителя.
2. Налейте растворитель(и), который вы будете использовать для колонки, в стеклянную емкость. Глубина растворителя должна составлять 2–3 мм, чтобы точечный образец не был погружен в него. Это гарантирует, что образец не растворится в растворителе и не будет перемещаться по пластине для ТЛК вместе с растворителем.
3. Используйте капиллярный споттер или микропипетку, чтобы “нанести” часть образца на пластину в левом нижнем углу (рис. 3, a). Пятно должно находиться на расстоянии примерно 0,5&ndash-1 см от нижнего и левого краев и диаметром 1&ndash-2 мм.
4. Поместите полоску TLC в контейнер с растворителем(ями).
5. Подождите и регулярно проверяйте TLC. Не перемещайте и не тревожьте пластину или контейнер с TLC, так как это приведет к ряби в растворителе и неравномерному продвижению фронта растворителя по пластине.
6. После того, как растворитель начнет двигаться по пластине.
7. Когда фронт растворителя будет находиться на расстоянии 0,5– 1 см от верха пластины, осторожно извлеките пластину из контейнера пинцетом.
8. Позвольте растворителю испариться.
9. Поверните пластину на 90 градусов так, чтобы исходное пятно образца оказалось в правом нижнем углу. Компонентные пятна (если они видны невооруженным глазом) образуют горизонтальную линию вдоль дна пластины (рис. 3, c).
10. Поместите пластину TLC обратно в контейнер с растворителем(ями).
11. Подождите и регулярно проверяйте ТЛК. Не перемещайте и не тревожьте пластину или контейнер TLC.
12. Когда фронт растворителя будет находиться на расстоянии 0,5– 1 см от верха пластины, осторожно извлеките пластину из контейнера пинцетом.
13. Позвольте растворителю на пластине испариться, а затем визуализируйте пластину с помощью УФ-лампы или окунания в перманганат калия.
14. Отметьте карандашом положение всех пятен. Проведите диагональную линию от угла, где был замечен образец, через пятно образца до противоположного угла. Соединения, стабильные на диоксиде кремния, появятся на диагонали. Если соединение разлагается на кремнеземе, его пятно окажется ниже диагональной линии (рис. 3).

Рисунок 3. Установка и процедура проведения 2D TLC для определения стабильности соединения на диоксиде кремния.

Если вы обнаружите, что ваше соединение не стабильно на диоксиде кремния, рассмотрите возможность использования глинозема или альтернативного метода очистки, например, кристаллизации или дистилляции. Также можно отложить очистку соединения и взять весь образец для следующего шага в вашей последовательности. В зависимости от следующей реакции ваше соединение может быть преобразовано в нечто более стабильное по отношению к кремнезему и легче поддающееся очистке.

Альтернативы полным колонкам:

Колонки могут отнимать много времени и не всегда необходимы. Если ваш образец представляет собой твердое вещество, перекристаллизация может быть более быстрым и простым методом удаления примесей. Если ваш образец содержит только незначительные примеси, кремнеземная пробка может быть более быстрой альтернативой. Для небольших образцов (~50 мг и менее) микроколонка может быть проведена за долю времени, которое требуется для полной колонки. Эти “быстрые и грязные” методы не дают такого хорошего разделения, как полная колонка, поскольку образец проводит меньше времени в контакте с кремнеземом. Однако в условиях, описанных выше, они могут сэкономить много времени и ресурсов.

Кремнеземная пробка

Кремнеземная пробка — это грубая альтернатива полной колонке. Она подходит только для образцов с высоким значением Rf и небольшим количеством примесей, которые прилипают близко к базовой линии (рис. 4).

Рисунок 4. Пример пластины TLC, показывающий образец, который может быть пригоден для очистки с помощью кремнеземной пробки.

Установка для кварцевой пробки аналогична колонке с фриттой, за исключением того, что она проводится в воронке с фриттой и боковым рычагом для подключения к вакуумной линии или водяному насосу (рис. 5). Тонкий слой песка помещается на дно воронки с фриттой, чтобы предотвратить прохождение кремнезема через фритту. Кремнезем помещают поверх песка методом суспензии (см. Упаковка колонок). Затем образец загружается на кремнезем таким же образом, как и в колонку.

Рисунок 5. Установка для работы с кварцевой пробкой.

Размер воронки и количество растворителя, собираемого в виде фракций, зависит от объема очищаемого образца. Фракции собираются в гораздо больших объемах, чем при использовании колонки. Типичные размеры фракций составляют 100– 200 мл. Круглодонные колбы должны быть заполнены наполовину. Если колбы будут заполнены более чем наполовину, вы рискуете потерять часть образца в вакуумную линию или водяной насос.

Если вы используете вакуумную линию, убедитесь, что вакуум не слишком высок. Во избежание этого держите кран частично открытым. Высокий вакуум в системе может привести к ударам в колбе и потере образца через вакуумную линию. Высокий вакуум также затрудняет удаление вакуумной линии, что может привести к высыханию кремнезема, если вакуум не будет удален достаточно быстро. По этим причинам водяной насос предпочтительнее линии высокого вакуума.

Для работы кварцевой пробки вам потребуется:

Воронка с отверстиями

Несколько круглодонных колб (4–6 — хороший ориентир. Всегда лучше иметь под рукой больше колб, чем вам на самом деле нужно)

Растворитель (растворители), который будет использоваться

Вакуумная линия или водяной насос

Метод:

1. Зажмите круглодонную колбу и поместите воронку с фриттой сверху.
2. Добавьте слой песка (около 0,5 см) в воронку.Метод сухой упаковки 2 также может быть использован, но с учетом количества кремнезема и ширины воронки, метод суспензии очень быстрый и простой.
3. Осторожно постучите по боковой стенке воронки пробковым кольцом или куском вакуумной трубки, чтобы помочь оседанию диоксида кремния и удалению любых пузырьков.
4. Добавляйте растворитель, пока воронка не станет почти полной.
5. На короткое время подсоедините вакуумную трубку к боковому рычагу воронки. Отсоедините ее, когда уровень растворителя будет примерно на 2– 3 мм выше уровня кремнезема.
6. Подключите вакуумную линию к боковому рычагу воронки.
7. Позвольте растворителю стечь под действием силы тяжести, пока он не сравняется с кремнеземом.
8. Ополосните стенки воронки, проливая растворитель по бокам. Следите за тем, чтобы не нарушить поверхность кремнезема.
9. Погрузите образец в воронку.
10. Поместите образец на кварц, равномерно распределив его пипеткой по поверхности кварца.
11. Добавьте достаточно растворителя, чтобы кремнезем не высыхал во время следующего шага (примерно 5 мм над уровнем кремнезема должно быть достаточно).
12. Поменяйте круглодонную колбу на пустую.Нажмите вакуум, пока уровень растворителя не будет примерно на 2– 3 мм выше уровня кремнезема.
13. Повторите шаги 10– 13 по мере необходимости.
14. Протестируйте каждую фракцию методом TLC, чтобы определить, какая из них содержит желаемый продукт.

Микроколонка

Если у вас есть небольшой образец (50 мг), в котором присутствуют лишь незначительные примеси, проведение микроколонки может избавить вас от необходимости проводить полную колонку. Микроколонки, как следует из названия, представляют собой миниатюрные колонки, которые быстро запускаются. Они также идеально подходят для разделения, требующего градиента растворителя, поскольку растворитель добавляется в небольших количествах, поэтому часто таким образом можно разделить соединения с очень похожими значениями Rf. 

Микроколонка изготавливается с помощью обычной одноразовой стеклянной пипетки Пастера и устанавливается точно так же, как и колонка (рис. 6). Следует выбрать систему растворителей, которая дает более низкое значение Rf, чем обычно, то есть для микроколонки подходит значение Rf 0,2, в то время как для полной колонки оно составляет 0,3.  

Рисунок 6. Установка для запуска микроколонки.

Для запуска микроколонны вам понадобится:

Одноразовая стеклянная пипетка (вторая пипетка может быть использована для помощи в настройке первой)

Хлопчатобумажная или стеклянная вата

Кремнезем

Песок (необязательно)

Пипетка-колба (для флэш-хроматографии)

Маленькая воронка/бумажная воронка

Метод:

1. Зафиксируйте пипетку в вертикальном положении с помощью зажимной подставки.
2. Поместите маленький шарик ваты или стекловаты в самое узкое место пипетки. Вторую пипетку можно использовать для протыкания шарика. Шарик не должен быть слишком плотно набит, так как это будет препятствовать потоку растворителя.
3. Наберите в пипетку небольшое количество растворителя.
4. Добавьте небольшое количество песка, чтобы обеспечить ровную поверхность для кремнезема (необязательно). Песок должен равномерно покрывать вату или стекловату, но не превышать 2 мм в толщину.
5. Насыпьте сухой диоксид кремния.
6. Насыпьте сухой диоксид кремния в пипетку с помощью маленькой воронки или бумажной воронки. Оставьте около 3–5 см свободного от кремнезема пространства в верхней части.
7. Добавьте растворитель в верхнюю часть пипетки и дайте ему стечь. Колбу пипетки можно прикрепить к верхней части и сжать в этот момент, чтобы ускорить поток растворителя и помочь кремнезему плотнее упаковаться.
8. Добавьте ваш состав и проведите элюцию как обычно. Используйте колбу пипетки, чтобы увеличить давление и скорость потока.
9. Часто доливайте растворитель, чтобы кремнезем не высыхал.

Дополнительным преимуществом работы микроколонки является то, что после завершения работы ее можно утилизировать в контейнер для острых предметов без необходимости очистки.

Резюме

На этом мы завершаем изучение колоночной хроматографии. Теперь вы должны уметь выбирать систему растворителей для вашего образца, решать какого размера колонку использовать, и знать какое количество кремнезема необходимо. После того, как вы их выбрали, необходимо тщательно упаковать колонку, поскольку пузырьки воздуха и трещины в кремнеземе могут свести на нет всю тщательную подготовку, которую вы провели при выборе прибора. Мы видели, что размер собранных фракций зависит от размера колонки и значения Rf и что скорость потока растворителя может влиять на разделение. Мы также рассмотрели некоторые общие проблемы, с которыми вы можете столкнуться, и способы их решения или даже предотвращения – и колонки – с помощью одного из “быстрых и грязных” методов.

И наконец, последний совет по ведению колонки: Не выбрасывайте НИЧЕГО, пока вы не будете полностью уверены, что фракции, которые у вас есть, — это те, которые вам нужны. Слишком легко предположить, что пятно, присутствующее только в одной фракции, является незначительной примесью, в то время как на самом деле это продукт, который вы пытались получить последние несколько дней/недель/месяцев.

Глоссарий общих терминов, используемых в колоночной хроматографии

Для столбцов
Колонковая хроматография	Метод, используемый для очистки отдельных химических соединений из смесей
Флэш-колонковая хроматография	Колоночная хроматография, проводимая под внешним давлением, создаваемым сжатым воздухом или N2. Это стало стандартной методикой, при этом колоночную хроматографию часто называют гравитационной хроматографией, чтобы отличить ее.
Стационарная фаза/абсорбент/кремнезем .	Твердый материал, используемый в колонке. Обычно это кремнезем (SiO2), но иногда глинозем (Al2O3).
Подвижная фаза/растворитель/элюент	Жидкость вылилась вниз по колонке.
Значение сетки	Значение ячеек описывает размер частиц стационарной фазы. Высокие значения ячеек означают более мелкие частицы.
Глинозем типа I, II или III	Глинозем бывает трех типов в зависимости от содержания в нем воды. Тип I содержит меньше всего воды, тип III — больше.
Полоса/пятно/элюат	Участок колонки, содержащий соединения. Полоса используется для обозначения самой колонки, а пятно — для описания TLC.
Расширение полосы	Процессы диффузии в колонке приводят к разрастанию образца. Расширение полосы неизбежно, но его можно минимизировать, сократив время пребывания образца на колонке. Правильная оптимизация всех параметров позволит свести к минимуму расширение полосы.
Хвостообразование/размазывание/разрыв/размывание	Все термины, используемые для описания чрезмерного расширения полосы на колонке или пластине TLC, что приводит к тому, что ваши полосы или пятна сливаются вместе.
Упаковка колонки	Процесс установки колонки. Включает добавление диоксида кремния, растворителя и обеспечение хорошего уплотнения диоксида кремния без пузырьков и пустот.
Загрузка колонки .	Процесс добавления образца в верхнюю часть колонки. Мокрая загрузка включает растворение образца в минимальном количестве растворителя и нанесение его пипеткой на верхнюю часть кремнезема. Сухая загрузка описана в статье выше.
Запуск колонны	Процесс сбора и тестирования фракций по мере их элюирования с колонки.
Для элюирования	Буквально: Вымываться. Используется в хроматографии в значении “сойти с колонки”.
Фракции	Порции растворителя, собранные с нижней части колонки. Обычно собираются в пробирки объемом 10– 50 мл.
Система растворителя	Сочетание двух или более растворителей, используемых в качестве подвижной фазы.
Для ТЛК
Тонкослойная хроматография (TLC)	Хроматография, выполняемая с помощью стеклянного или алюминиевого листа или пластины, покрытых тонким слоем кремнезема или другой неподвижной фазы. Используется в качестве краткого руководства для колоночной и флэш-колоночной хроматографии.
Капиллярный TLC споттер/споттер	Инструмент, используемый для добавления образца на пластину для ВЭЖХ. (См.: Как сделать капиллярный TLC-споттер) .
Rf Значение	Rf = Расстояние, пройденное соединением от базовой линии, деленное на расстояние, пройденное фронтом растворителя от базовой линии
Фронт растворителя	Передняя кромка растворителя. Он движется вниз по колонке, но вверх по пластине TLC
Базовый уровень	В TLC линия, на которую наносится образец. Также верхняя часть колонки, куда загружается образец.
Разрешение/растворение/разделение	Измерение того, насколько хорошо каждый компонент в образце изолирован от других компонентов. Хорошее разрешение или разделение означает, что каждый компонент может быть чисто и легко собран в отдельные фракции.
Неформальные термины:	Часто используются в лабораторных работах, но их следует избегать в официальных письмах/речи.
В колонку/Колумнирование	Может использоваться как глагол в лаборатории, но его следует избегать при написании отчета. Предпочтительной фразой в документах является “X был очищен колоночной хроматографией” или “X был очищен колоночной хроматографией”.
Сухой	Когда уровень растворителя опускается ниже уровня кремнезема. Это может привести к появлению пузырьков и трещин в кремнеземе, что нарушает разделение соединений.