Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) — это аналитический метод для разделения, идентификации и количественного определения компонентов в смеси. Это самый крупный метод хроматографии, необходимый для большинства лабораторий по всему миру.
Как работает ВЭЖХ?
В колоночной хроматографии растворитель капает через колонку, заполненную адсорбентом, под действием силы тяжести. ВЭЖХ — это усовершенствованная форма колоночной хроматографии. Насос продавливает растворитель через колонку под высоким давлением до 400 атмосфер. Упаковочный материал колонки, адсорбент или неподвижная фаза обычно представляет собой гранулированный материал из твердых частиц, таких как кремнезем или полимеры.
Давление делает метод гораздо более быстрым по сравнению с колоночной хроматографией. Это позволяет использовать гораздо более мелкие частицы для упаковочного материала колонки. Частицы меньшего размера имеют гораздо большую площадь поверхности для взаимодействия между неподвижной фазой и проходящими через нее молекулами. Это приводит к гораздо лучшему разделению компонентов смеси.
Жидкость под давлением обычно представляет собой смесь растворителей, таких как вода, ацетонитрил и/или метанол, и называется подвижной фазой.
Компоненты смеси отделяются друг от друга благодаря различной степени их взаимодействия с абсорбирующими частицами. Это вызывает различную скорость элюирования для разных компонентов и приводит к разделению компонентов по мере их вытекания из колонки. По сравнению с колоночной хроматографией, ВЭЖХ высокоавтоматизирована и чрезвычайно чувствительна.
Типы ВЭЖХ
Два наиболее распространенных варианта — это нормально-фазовая и обращенно-фазовая ВЭЖХ.
Нормально-фазовая ВЭЖХ
Колонка заполнена мельчайшими частицами кремнезема и неполярным растворителем, например, гексаном. Типичная колонка имеет внутренний диаметр 4,6 мм или меньше и длину от 150 до 250 мм. Неполярные соединения в смеси будут быстрее проходить через колонку, поскольку полярные соединения дольше прилипают к полярному кремнезему, чем неполярные.
ВЭЖХ с обращенной фазой
Размер колонки тот же. Колонка заполнена частицами диоксида кремния, которые модифицированы, чтобы сделать их неполярными. Это делается путем присоединения длинных углеводородных цепочек (8–18 атомов С) к ее поверхности. Используется полярный растворитель, например, смесь воды и спирта, такого как метанол. Полярные соединения в смеси будут быстрее проходить через колонку, поскольку между полярным растворителем и полярными молекулами в смеси возникает сильное притяжение.
Неполярные молекулы замедляются на пути через колонку. Они образуют различные степени притяжения с углеводородными группами в основном за счет дисперсионных сил Ван-дер-Ваальса и гидрофобных взаимодействий. Они также менее растворимы в компонентах водной подвижной фазы, что облегчает их взаимодействие с углеводородными группами.
ВЭЖХ с обращенной фазой — наиболее часто используемая форма ВЭЖХ.